Biologické čistenie odstraňuje rozpustné organické látky, nutrienty ako dusík a fosfor, a väčšinu nerozpustených pevných látok, ktoré neboli odstránené pri mechanickom čistení. Uskutočňuje sa pôsobením mikroorganizmov (aktivovaný kal) a je výsledkom ich metabolickej činnosti. Postupy biologického čistenia odpadových vôd delíme obecne na technológie s biologickou kultúrou osadenou na pevnom povrchu (biologické filtre) a na technológie s biologickou kultúrou vo vznose (aktivačné nádrže).
Aktivácia (aktivačný proces) v podstate znamená kontinuálnu kultiváciu mikroorganizmov (aktivovaného kalu), ktoré sú už prítomné v odpadovej vode a vo vratnom aktivovanom kale. Vločky aktivovaného kalu obsahujú organizmy, ktoré odstraňujú znečistenie v aeróbnom či oxickom, anoxickom alebo anaeróbnom prostredí. Akonáhle sú znečisťujúce látky odstránené, aktivovaný kal vo forme vločiek sa separuje od vody v usadzovacej nádrži gravitáciou. Časť kalu (vratný aktivovaný kal) na dne usadzovacej nádrže potom recirkuluje späť, aby sa zmiešal s mechanicky predčistenou vodou. Zvyšok kalu (prebytočný aktivovaný kal) sa odstráni, aby sa neporušila ideálna rovnováha mikroorganizmov. Biofiltre – nádrže vyplnené médiom využívajú prichytenie mikroorganizmov na médiu a vytvorenie biologického filmu. Odpadová voda sa po mechanickom predčistení nastrekuje na médium pokryté biofilmom, v ktorom mikroorganizmy odstraňujú znečisťujúce látky. Rovnako ako pri aktivácii sa voda s fragmentmi biofilmu a vločiek z biologického filtra odvádza do usadzovacej nádrže na separáciu, kde se kal recykluje a likviduje, a čistá voda sa vypúšťa do ďalšieho procesu.
Pre efektívne fungovanie biologického čistenia vyžadujú organizmy nutrienty vo vyváženom pomere, vrátane uhlíka, dusíka a fosforu (pomer C:N:P), ďalej stopové prvky vrátane železa, medi, zinku, niklu, mangánu, draslíku, síry a ďalších zložiek, ktoré sú typicky prítomné v odpadovej vode. Obecne používaný pomer C:N:P je 100:5:1, avšak niektoré ČOV fungujú optimálne pri inom pomere, zatiaľ čo iné sa potykajú s tvorbou polysacharidového slizu alebo nárastom vláknitých baktérií, ktoré inhibujú biológiu a usadzujú sa v usadzovacej nádrži.
Pre dokončenie biologického čistenia je možné použiť viacero spôsobov: aktiváciu s cirkuláciou, zmiešavaciu aktiváciu, sekvenčné dávkové reaktory (SBR), oxidačné príkopy, biofiltre, bioreaktory s pohyblivým lôžkom, spojenie biofilmu so suspendovaným aktivovaným kalom (IFAS) a ďalšie.
Biologické odstraňovanie nutrientov využíva zmeny prostredia mikroorganizmov tak, aby sa z vody odstránil dusík a fosfor. Tieto biologické pochody sa delia na zónu anaeróbnu (bez kyslíka a dusičnanov), anoxickú (bez kyslíka, dusičnany sú prítomné) a aeróbnu/oxickú (kyslík je prítomný), kedy voda „putuje“ kvôli svojmu biologickému vyčisteniu jednotlivými zónami.
Je možné tiež použiť chemické postupy, ako napríklad chemické odstraňovanie fosforu, kedy sa dávkuje zrážadlo do aktivácie alebo do odtoku z aktivácie pred usadzovaciu nádrž. Nerozpustné zlúčeniny vzniknuté zrážaním sa potom separujú spoločne s kalom.